Alla fine del Duecento e fino alla metà del Quattrocento la pieve di San Lorenzo fu sede di uno dei quattro arcipretati in cui era suddivisa la diocesi di Treviso, da ciascuno dei quali dipendevano più cappelle o regole.
Passata Mestre sotto il dominio della Repubblica di Venezia (1337-39), la chiesa si trovava in uno stato molto precario: il Consiglio dei cittadini di Mestre, che deteneva la proprietà di San Lorenzo e la amministrava tramite un «sindaco» eletto ogni tre anni, ne decise la ricostruzione, approvata dal Senato veneziano il 29 luglio 1388. Il nuovo edificio, innalzato intorno al 1446 secondo la relazione scritta dall'arciprete Giacomo Albrizzi in occasione della visita pastorale del vescovo di Treviso Paolo Francesco Giustiniani nel 1791, ma probabilmente già in buona parte costruito nel 1398, era a tre navate, con dieci archi che separavano la navata centrale da quelle laterali, con l'altare maggiore a levante e l'ingresso a ponente; aveva il campanile in legno ed era circondato da un cimitero. Venne consacrato, secondo lo storico mestrino Carlo Agnoletti, nel 1515, durante la fiera di San Michele.
Alla metà del Settecento, trovandosi la chiesa nuovamente in stato di degrado ed essendo ormai insufficiente per accogliere l'accresciuta popolazione, il Consiglio dei cittadini, con parte del 27 luglio 1770, decise la sua ricostruzione dalle fondamenta. Venne inoltre deciso l'ampliamento della proprietà di San Lorenzo a tutte le categorie sociali, con l'elezione di quattro «sindaci» a rappresenza di artisti, pescatori, barcaioli e villici; la parte trovò esecuzione solo nel 1779.
Intanto con decreto del vescovo Giustiniani del 26 settembre 1777 a San Lorenzo venne riconfermato l'antico titolo onorifico di collegiata.
La chiesa, costruita su progetto dell'architetto veneziano Bernardino Maccaruzzi, venne completata nel 1805 e consacrata il 24 ottobre 1830 dal vescovo Sebastiano Soldati, durante l'arcipretato di Carlo Maria Belcavello.
La bolla apostolica "Ob nova praesentis temporis adiuncta" del papa Pio XI, datata 14 febbraio 1927, segnò il distacco di San Lorenzo di Mestre dalla diocesi di Treviso e il suo passaggio alla diocesi di Venezia.
Una lista dei «Parroci della chiesa colleggia arcipretale di S. Lorenzo di Mestre dall'anno 1232 fino al 1832» compilata da Bonaventura Barcella si trova in G. ALBRIZZI, A. FAPANNI, B. BARCELLA, La chiesa di San Lorenzo negli anni della rifabbrica, a cura di G. ZOCCOLETTO, Mestre 1993, pp. 85-88.