ArciLesbica nasce dall'esigenza di portare avanti, attraverso la costituzione di una struttura pienamente autonoma da un punto di vista di rappresentanza e di statuto, una politica efficace ed incisiva per ribadire in maniera chiara ed autorevole la presenza e l'identità lesbica, individuale e collettiva, in ogni luogo che la neghi o che non la preveda. Favorire la visibilità lesbica, intesa come visibilità di movimento collettivo e visibilità personale, promuovere la lotta alle discriminazioni basate sull'orientamento sessuale, garantire il pieno diritto alla salute attraverso la formazione e la preparazione di operatori sanitari aperti al rapporto con le fruitrici lesbiche, creare un punto di vista lesbico sul mondo costituiscono i fondamenti dell'azione politica dell'associazione, attraverso il confronto con il movimento lesbico separatista, con il movimento gay maschile, con i partiti e le istituzioni locali e con tutte quelle associazioni e realtà disponibili al dialogo.
Già a partire dai suoi primi anni di vita, l'associazione è in grado di ottenere un forte accreditamento da parte delle istituzioni, delle forze politiche e sociali e dei mass media, anche grazie allo sviluppo dei circoli attivi sul territorio nazionale e alle iniziative di livello locale (rassegne cinematografiche, conferenze, dibattiti, incontri), nazionale (adesione alla Convenzione delle Donne contro la guerra, partecipazione alla manifestazione dei Tre Giorni sull'Erotismo a Milano del 1998, sostegno alla V Campagna per la prevenzione dell'HIV promossa dal Ministero della Sanità nello stesso anno) e internazionale (partecipazione al Forum Europa Donna per la prevenzione del tumore al seno e all'International Lesbian and Gay Association). ArciLesbica è presente in tutti i gaypride e in molte manifestazioni miste in difesa della pace, della scuola pubblica e a favore delle unioni civili.
Nel maggio 2001 l'elezione alla Camera dei Deputati del presidente onorario di Arcigay Franco Grillini e della presidente di Arcilesbica Titti De Simone realizza uno dei maggiori obiettivi dell'associazione: condurre il lesbismo fuori dalla dimensione privata per porlo al centro della sfera politica pubblica, rivendicando la possibilità di unioni civili, l'accesso della donna maggiorenne alle tecniche di riproduzione assistita (TRA), le adozioni per i singoli o le coppie omosessuali, la formulazione di leggi antidiscriminatorie a tutela dei singoli.
Il confronto con le realtà del movimento gay, lesbiche, bisessuali e transessuali (GLBT) e l'influenza delle teorie «queer» sul carattere socialmente costruito dell'identità sessuale hanno ampliato il raggio della creatività culturale dell'associazione e della sua attività politica, estendendo il tesseramento anche alle donne trans presentate dalle associazioni transessuali e transgender con cui ArciLesbica collabora.
Negli anni successivi l'associazione collabora attivamente alla stesura di documenti politici contro il razzismo e le discriminazioni da sottoporre alle istituzioni, in particolare al Ministero Diritti e Pari Opportunità. Nel 2007 concorre alla costruzione dei contenuti dell'Anno europeo delle pari opportunità per tutti collaborando attivamente con ministeri, enti locali, sindacati, organizzazioni non governative (ONG) europee contro la discriminazione, vincendo tra l'altro, insieme ad ArciGay, un bando per la realizzazione di uno studio di fattibilità per la costituzione di un Osservatorio nazionale contro tutte le discriminazioni e sollecitando i circoli locali a partecipare ai bandi di finanziamento emessi dalle istituzioni locali per la realizzazione di nuovi progetti contro l'omofobia. Grande attenzione viene prestata inoltre alla progettazione di interventi contro il mobbing e lo stalking e di aiuto alle lesbiche che subiscono violenza, in partnership con le istituzioni locali, nazionali ed internazionali.
In base al più recente Statuto, approvato nel dicembre 2008 in occasione del V congresso di ArciLesbica, sono organi nazionali di direzione dell'associazione: il Congresso nazionale, organo d'indirizzo politico dell'associazione che provvede, tra le altre cose, all'elezione della Segreteria nazionale, del Collegio delle garanti e del Collegio delle revisore dei conti; l'Assemblea nazionale delle associate, organo di governo e rappresentanza che definisce le modalità di realizzazione del programma, convoca il Congresso ed esercita un'azione di controllo politico e finanziario sull'operato degli organi da esso eletti; la Segreteria nazionale, organo esecutivo dell'associazione con compiti di intermediazione e coordinamento tra gli enti aderenti; la Presidente nazionale, portavoce ufficiale dell'associazione eletta tra le componenti della Segreteria; la Tesoriera, eletta tra le componenti della Segreteria con il compito di attuare le scelte amministrative degli indirizzi di bilancio fissati dall'Assemblea nazionale; il Collegio delle garanti, organo di garanzia statutaria, regolamentare e di giurisdizione interna dell'associazione; il Collegio delle revisore dei conti, organo di controllo amministrativo.
Sul territorio ArciLesbica è articolata in circoli affiliati che aderiscono alle finalità promosse dallo statuto nazionale e si configurano come spazi di aggregazione politica, sociale e culturale; possono comunque aderire ad ArciLesbica le singole donne, i collettivi, i circoli, le associazioni e tutti i tipi di enti che si riconoscano nel progetto politico e culturale, purché composti e diretti solo da donne e organizzati in forma autogestita e democratica. Dal 2008 inoltre i circoli possono prevedere un tesseramento di sostegno «Amici di ArciLesbica» rivolto ad un pubblico misto per favorire la partecipazione anche maschile alle attività culturali e ricreative, qualora l'ente che le organizza preveda la partecipazione mista.